Primer Design Tool

PCR 프라이머 설계/Tm 계산기

25개 결과

Primer Design Tool 소개

PCR 프라이머 설계 레퍼런스는 중합효소 연쇄반응을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 설계의 모든 측면을 다루는 종합 가이드입니다. Nearest-Neighbor 열역학적 Tm 계산 공식(Tm = dH / (dS + R*ln(Ct/4)) - 273.15), GC 함량 분석(이상 범위 40-60%), 3' 말단 안정성 평가, 자가 상보성/헤어핀/교차 다이머 검사를 자유 에너지(dG) 임계값과 함께 제공합니다.

표준 PCR, qPCR(70-200 bp 앰플리콘), 점 돌연변이 도입, IUPAC 코드 활용 축퇴 프라이머, Gibson Assembly 오버랩 프라이머, Bisulfite PCR, 제한효소 인식 서열 추가 등 다양한 PCR 응용별 프라이머 설계 매개변수를 상세히 다룹니다. 염 농도 보정 공식, GC-rich 주형용 DMSO/Betaine 보정, Primer3/NCBI Primer-BLAST/IDT OligoAnalyzer 도구 사용법도 포함됩니다.

분자생물학자, 유전학 연구자, 생명공학 학생을 위해 설계된 이 레퍼런스는 프라이머 설계 규칙, Tm 계산 방법, PCR 최적화 전략을 별도의 설치나 서버 처리 없이 빠르게 조회할 수 있습니다.

주요 기능

Nearest-Neighbor 열역학적 Tm 계산 — 엔탈피/엔트로피 매개변수 및 염 보정 공식 포함
GC 함량 분석 가이드라인 — 이상 범위 40-60%와 GC 클램프 권장사항
자가 다이머, 교차 다이머, 헤어핀 자유 에너지(dG) 임계값 레퍼런스
qPCR, 돌연변이 유발, 축퇴, Gibson Assembly, Bisulfite PCR 등 응용별 설계 규칙
어닐링 온도 계산법 — 그래디언트 및 터치다운 PCR 전략 포함
IUPAC 축퇴 염기 코드 및 합의 프라이머 설계를 위한 축퇴도 계산
제한효소 인식 서열 추가 프라이머 구조 — 보호 서열과 인식 서열 배치
Primer3 매개변수, NCBI Primer-BLAST 워크플로, IDT OligoAnalyzer 기능 레퍼런스

자주 묻는 질문

Nearest-Neighbor 방법으로 프라이머 Tm을 어떻게 계산하나요?

Nearest-Neighbor 방법은 Tm = dH / (dS + R * ln(Ct/4)) - 273.15 공식을 사용합니다. dH는 인접 염기쌍의 엔탈피 합, dS는 엔트로피 합, R은 기체 상수(1.987 cal/mol/K), Ct는 총 올리고뉴클레오티드 농도입니다. 이 방법은 인접 염기 간 스태킹 상호작용을 고려하여 가장 정확한 Tm 예측을 제공합니다.

PCR 프라이머의 이상적인 GC 함량과 길이는 얼마인가요?

PCR 프라이머의 이상적인 GC 함량은 40-60%로, 결합 강도와 특이성 사이의 균형을 제공합니다. 프라이머 길이는 18-25 nt가 권장됩니다. 3' 말단에 G 또는 C로 끝나는 GC 클램프는 프라이머 결합을 안정화합니다. 3' 말단에 3개 이상 연속 G/C는 비특이적 결합을 유발할 수 있으므로 피해야 합니다.

프라이머의 자가 다이머와 헤어핀은 어떻게 확인하나요?

자가 다이머는 프라이머 서열 내 상보성을 평가하여 확인합니다. 허용 임계값은 자가 다이머 dG > -3.5 kcal/mol, 헤어핀 dG > -2 kcal/mol입니다. 헤어핀 Tm은 어닐링 온도보다 최소 5도 낮아야 합니다. 프라이머 쌍 간 교차 다이머는 dG > -5 kcal/mol이어야 합니다. Primer3과 IDT OligoAnalyzer에서 자동으로 검사할 수 있습니다.

qPCR 프라이머의 최적 설계 조건은 무엇인가요?

qPCR 프라이머의 이상적인 앰플리콘 크기는 70-200 bp(최적 100-150 bp)이며, Tm 범위는 58-62도입니다. 게놈 DNA 증폭을 방지하기 위해 엑손 접합부 스패닝이 권장됩니다. SYBR Green 분석에는 프라이머 쌍만 필요하고, TaqMan 분석에는 프라이머보다 Tm이 8-10도 높은 프로브가 추가로 필요합니다.

염 농도가 프라이머 Tm에 미치는 영향은 무엇인가요?

염 농도는 프라이머 Tm에 직접적인 영향을 미칩니다. 보정 공식은 Tm(보정) = Tm + 16.6 * log10([Na+])입니다. 50 mM KCl이 포함된 표준 PCR 버퍼에서 유효 나트륨 등가는 [K+] + 4*sqrt([Mg2+])로 계산됩니다. Mg2+ 농도를 높이면 Tm이 상승하며, 일반적인 MgCl2 농도는 1.5-2.5 mM입니다.

Gibson Assembly용 프라이머는 어떻게 설계하나요?

Gibson Assembly 프라이머는 15-25 bp 오버랩 영역(Tm >= 48도)과 유전자 특이 서열(Tm 60-72도)의 두 부분으로 구성됩니다. 벡터와 인서트 양쪽 접합부에 각각 20 bp 이상의 상동 서열이 필요합니다. 오버랩 영역이 Gibson Assembly 효소에 의한 원활한 연결을 가능하게 합니다.

GC-rich 주형에서 DMSO와 Betaine 보정의 차이는 무엇인가요?

DMSO(2-10%)는 1% 당 약 0.6도 Tm을 낮추며 GC-rich 영역의 이차 구조를 해소합니다. Betaine(1-1.5 M)은 Tm에 큰 영향 없이 AT와 GC 염기쌍의 안정성 차이를 균등화합니다. 70% 이상 GC 함량의 주형에는 일반적으로 5% DMSO를 사용하여 증폭 효율을 개선합니다.

프라이머에 제한효소 인식 서열을 어떻게 추가하나요?

제한효소 인식 서열 추가 프라이머는 [보호 서열 2-6 nt] - [제한효소 인식 서열] - [주형 상보 서열 18-22 nt] 구조를 따릅니다. 인식 서열 상류의 보호 서열은 PCR 증폭 후 효소의 효율적인 절단에 필수적입니다. 예를 들어, EcoRI 서열 추가: 5'-gcgcGAATTCatgxxxxx...-3'입니다.